Высокоэффективное получение монодисперсных внеклеточных везикул, полученных из плазматической мембраны, для терапевтического применения.

Биология связи, том 6, Номер статьи: 478 (2023) Цитировать эту статью

1840 Доступов

82 Альтметрика

Подробности о метриках

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют большой интерес для разработки терапевтических средств нового поколения. Однако методы их приготовления сталкиваются с проблемами стандартизации, выхода и воспроизводимости. Здесь мы описываем высокоэффективный и воспроизводимый метод приготовления EV для монодисперсных везикул наноплазменной мембраны (nPMV), который дает в 10–100 раз больше частиц на клетку в час, чем традиционные методы приготовления EV. nPMV производятся путем гомогенизации гигантских пузырьков плазматической мембраны после образования пузырьков клеточной мембраны и апоптотической секреции организма, вызванной химическими стрессорами. nPMV не показали существенных различий по сравнению с нативными EV из той же клеточной линии в крио-TEM-анализе, клеточных взаимодействиях in vitro и исследованиях биораспределения in vivo на личинках рыбок данио. Протеомика и липидомика, с другой стороны, предположили существенные различия, соответствующие различному происхождению этих двух типов EV, и показали, что nPMV в основном происходят из апоптотических внеклеточных везикул. nPMV могут стать привлекательным источником для разработки фармацевтических препаратов на основе ЭМ.

Внеклеточные везикулы (ВВ) представляют собой мембранные везикулы клеточного происхождения, которые несут специфические для клеток липиды, белки (т. е. ферменты, молекулы клеточной адгезии, кластер белков дифференцировки (CD)), нуклеиновые кислоты (т. е. различные РНК и ДНК), метаболиты. , органеллы, а иногда даже вирусы1,2. ЭВ подразделяются на две основные категории в зависимости от их биогенеза: экзосомы и эктосомы2. Экзосомы представляют собой небольшие ЭВ (диаметром 40–150 нм), происходят из эндосомального компартмента клетки и постоянно высвобождаются в окружающую среду прокариотическими и эукариотическими клетками посредством экзоцитоза мультивезикулярных телец или амфисом2,3,4. Эктосомы, с другой стороны, образуются путем прямого отпочкования/взрыва плазматической мембраны и включают большую группу различных типов везикул, включая микровезикулы, апоптотические тельца (ApoBD), апоптотические внеклеточные везикулы (ApoEV) и большие онкосомы. Эктосомы имеют сильно варьирующие размеры от 50 до >1000 нм2,5,6. На основании результатов протеомного и липидомного анализа было показано, что ЭВ имеют определенный молекулярный отпечаток пальца, унаследованный от клеток-доноров (предшественников)7,8. В живых организмах они могут взаимодействовать с клетками, удаленными от их происхождения, интернализоваться для высвобождения своего содержимого и вызывать фенотипические изменения, включая изменения в сигнальных событиях2,9,10. Для целей доставки лекарств на клеточных и животных моделях были предложены различные стратегии загрузки ЭВ терапевтическими нуклеиновыми кислотами, белками или лекарствами с низкой молекулярной массой11. Хотя большая часть исследований ЭВ в области терапевтического применения все еще находится на доклинической фазе, небольшое количество исследований переходит в клинические испытания на людях12,13. Несмотря на большой интерес к технологиям на основе ЭМ (и, в частности, экзосом), прогресс замедлился не только, но и отчасти из-за проблем с масштабным производством. Типичная скорость секреции ЭВ составляет всего 60–170 частиц/клетку/час, а производство сильно зависит от типа используемых клеток14,15. Таким образом, производство большого количества электромобилей требует значительного количества донорских клеток и отнимает много времени. Кроме того, процессу препятствуют изоляция, очистка и субфракционирование производимых электромобилей16. Ситуация еще больше осложняется различиями между протоколами и условиями экспериментов, используемыми отдельными лабораториями. Поэтому обществами ЭВ разрабатываются руководящие принципы по стандартизации методов производства и характеристики, чтобы ускорить доклинические исследования и, в конечном итоге, клинический перевод терапевтических средств на основе ЭВ12,17. Было исследовано несколько подходов к увеличению доходности электромобилей. Механическая экструзия или сдвиговое напряжение целых клеток приводило к более высокому выходу ЭВ-подобных нановезикул с физико-химическими и биологическими свойствами, аналогичными нативным ЭВ18,19. Кроме того, стресс донорских клеток существенно увеличивал секрецию ЭВ в различных моделях20,21,22,23,24. Поэтому из-за ограничений стандартных лабораторных протоколов приготовления ЭВ целью настоящего исследования была разработка эффективного метода приготовления монодисперсных ЭВ с высокой воспроизводимостью. Гигантские везикулы плазматической мембраны (GPMV) образовывались в результате апоптоза клеток, вызванного химическими стрессорами, и последующего мембранного пузырения. GPMV были исследованы для использования в качестве исходного материала (рис. 1) для производства электромобилей. После этого размер GPMV был уменьшен путем экструзии с получением пузырьков наноплазменной мембраны (nPMV). Затем nPMV были охарактеризованы рядом с нативными ЭВ, выделенными из той же донорской клеточной линии, чтобы сравнить выходы и скорости их продукции, физико-химические свойства, 2D- и 3D-морфологию (с использованием криогенной трансмиссионной электронной микроскопии, крио-ТЕМ), молекулярный состав. (протеомика и липидомика), клеточные взаимодействия in vitro, а также биораспределение in vivo с использованием трансгенных (Tg) личинок рыбок данио (ZFL) в качестве фармакокинетической модели позвоночных.