Микрокапсулы из агарозного геля позволяют легко

Том 12 научных отчетов, номер статьи: 17014 (2022) Цитировать эту статью

4507 Доступов

30 Альтметрика

Подробности о метриках

Для получения высококачественной одноклеточной амплифицированной геномной ДНК бактерий был разработан новый тип микрокапсул в агарозном геле (АГМ), состоящий из ядра альгинатного пиколитрового золя и оболочки из агарозного геля. AGM легко приготовить в виде стабильной эмульсии с маслом водоэквивалентной плотности, что предотвращает агрегацию AGM, используя только стандартное лабораторное оборудование. Отдельные клетки из чистой культуры Escherichia coli, ложного сообщества, включающего 15 штаммов кишечных бактерий человека, и бактериального сообщества кишечника термитов были инкапсулированы в AGM, а образцы их геномной ДНК были приготовлены с массовыми параллельными амплификациями в пробирке. Секвенирование генома не требовало повторной амплификации и показало среднюю полноту генома, которая была намного выше, чем полученная с использованием традиционного метода амплификации в микролитровом масштабе, независимо от содержания в геноме гуанина-цитозина. Наш новый метод с использованием AGM позволит многим исследователям легко и эффективно выполнять геномику отдельных клеток, а также может ускорить геномный анализ еще не культивируемых микроорганизмов.

Микроорганизмы повсеместно распространены в различных средах. Они часто связаны с другими организмами и играют важную роль в экосистемах. Однако большинство видов микробов трудно культивировать традиционными методами, и их называют еще некультивируемыми микроорганизмами1. За последние два десятилетия они широко изучались с использованием независимых от культуры методов, таких как анализ секвенирования ампликонов генов малых субъединиц рибосомальной РНК (SSU рРНК) и анализ секвенирования метагеномов. Метагеномика — мощный инструмент для изучения экологических и физиологических функций микробиоты на основе их закодированного генетического репертуара. Недавнее развитие компьютерного объединения метагеномных фрагментов в соответствующие микробные таксономические сборки усилило полезность метагеномики2,3. Однако вычислительное биннинг, основанное на составе последовательностей, гомологии с последовательностями базы данных и охвате чтения последовательности каждого фрагмента, часто не позволяет различить геномы близкородственных (под)видов и правильно отсортировать геномные области, демонстрирующие особенности, отличные от других, таких как рРНК. гены, профаги и плазмиды4,5. Кроме того, необходимы масштабные усилия по секвенированию для получения последовательностей генома второстепенных видов микробного сообщества3.

Геномика одиночных клеток, при которой целая геномная ДНК амплифицируется из физически изолированных одиночных клеток6, используется в качестве альтернативного или дополнительного метода для выявления метаболической способности еще некультивируемых микроорганизмов1,7. Выделение отдельных клеток во многих случаях может быть достигнуто с использованием таких технологий, как сортировка клеток, активируемая флуоресценцией (FACS)1, микроманипуляторы8, микрофлюидные устройства9,10 и инкапсуляция в каплях воды в масле11. Хотя были разработаны различные методы амплификации всего генома12, наиболее широко используется множественная амплификация смещения (MDA) с использованием ДНК-полимеразы phi29 со случайными праймерами из-за ее относительной простоты, надежности и применимости6,13. Однако MDA по своей сути демонстрирует крайнюю систематическую ошибку амплификации среди областей генома1, что было основным техническим ограничением в одноклеточной геномике. Кроме того, высокое содержание гуанина-цитозина (GC) в геномной ДНК имеет тенденцию увеличивать погрешность амплификации1,14. Смещение амплификации можно подавить, используя небольшие реакционные сосуды; например, микроканальные камеры (60 нл)10, нанолитровые микролунки (12 нл)15, виртуальная микрофлюидика (МДА в гелевом листе, 60 нл)16, цифровые капли, генерируемые с помощью микроканала (9,5–240 пл)17,18, 19 и гелевые бусины20. Однако эти методы микрообработки недоступны для многих микробиологов, а количество продукта амплификации часто слишком мало для прямого секвенирования генома; поэтому часто требуется второй раунд MDA, что в конечном итоге усиливает погрешность усиления21.

1 kb were used for the subsequent analyses. Several factors describing the genome sequence quality, including completeness and contamination rate, were evaluated using CheckM29 and QUAST30 and compared between the SAGs obtained using MDA-in-AGM and FACS-MDA./p> 5% of the mock community with the exception of Faecalibacterium prausnitzii (Supplementary Table S4). For example, SAGs of Bacteroides thetaiotaomicron and Parabacteroides distasonis exhibited clear differences between MDA-in-AGM and FACS-MDA in genome completeness, number of contigs, and amplification bias, as seen in the E. coli SAGs (Fig. 3, Supplementary Fig. S5). Since many SAGs obtained from environmental samples were difficult to compare at the same coverage due to lack of their reference genomes, the mock SAGs were assembled using 0.3 M read pairs in the following experiments. The overall genome completeness of SAGs with < 5% contamination was significantly higher in MDA-in-AGM (68.0% ± 23.3%, n = 39) than in FACS-MDA (42.4% ± 20.5%, n = 36) (P < 0.01) (Supplementary Tables S5, S6). The SAGs of most other strains also showed similar results to the E. coli SAGs (Supplementary Fig. S6)./p> 5% contamination, which would be caused either by contaminating extracellular DNA or by multiple cells being encapsulated in a single AGM, were binned into each bacterial species using metaWRAP31, although discrimination between contaminating DNA and DNA from captured multiple cells was difficult. As a result, 30 additional SAGs with < 5% contamination were obtained, and their genome completeness and contamination rates were 73.5% (median) and 0.9% (median), respectively (Supplementary Table S8)./p>

1 kb contigs were selected using the SeqKit (https://bioinf.shenwei.me/seqkit/) for the subsequent analyses./p> 5% contamination, identified using CheckM29, were sequentially subjected to binning, refinement, and reassembly processes with the BINNING (including metaBAT259, MaxBin260 and CONCOCT61), BIN_REFINEMENT, and REASSEMBLE_BINS modules of metaWRAP31./p>

Блог